英国妊娠期血型和抗体检测试验指南
引言
指南的目的
指南的目的是来规范妊娠期应用红细胞免疫学试验。此类试验的目标是用来预防胎儿和新生儿溶血性疾病。主流刊物使用新生儿溶血性疾病这个词，HDN，这里就是指胎儿和新生儿溶血性疾病。
指南编写人是由医学专家和英国病人代表组成。用Pubmed, Cochrane Library 和 Ingenta databases对出版文献进行检索。基于回顾性研究NICE guidance [NICE, 2002]和Health Technology Assessment [Chilcott et al, 2002]支持这证据。用于回顾性目的也用一个全面文献检索来寻找信息。在2004年用Medline对过去二十年文献进行检索，关键词是抗-D，预防，妊娠期抗体，新生儿溶血性疾病。除此之外，用Cochrane Library 和Medscape进行广范围的检索。综合和利用未发表的适当的文献，公布的政策文档和这领域的专家的知识。组成写作团体来综合和校对这些信息。时间跨度从1999-2004。用CASP 评估工具 (CASP, 2004)的作者对包括的文件进行批判性阅读，并根据论据等级进行分类。在2000年(Chilcott et al, 2003)这种路径采用NICE系统性回顾分析，来同步定位和包含相关文献。写作团队起草草案规划，随后由英国血液病学标准委员会输血任务限制的成员一致通过修订。英国血液病学标准委员会(British Committee for Standards in Haematology)和英国社会健康委员会(British Society for Haematology)一致评述了这个指南，并在适当地方作了注释。在http:www.ahrq.gov (Appendix 1)网站上，医疗保健和质量机构概括了论据设计水平和推荐等级的标准。
重要进展
自早期的指南[BCSH-a,1996]出版后至今，在实验室实践方面已做了一些改进，尤其是应用单克隆试剂和自动化设备。严重输血危害[SHOT]溶血预警机制[Stainsby et al, 2004]已集中注意到血型分型、红细胞血清学试验、已出版在输血实验室的校订的配血实验指南中[BCSH-b, 2004]上。
引进监测胎儿贫血的非侵入性技术已经影响同种异体免疫妊娠的处理[Mari, 2000]，新生儿监护中心对溶血病例的集中关注改善宫内输血的结局。
更值得注意的是，在2002年五月，英国国家临床评价鉴定机构(NICE)支持对在英国所有没有检测抗D的D阴性妇女进行孕前常规抗D预防(RAADP)的建议[NICE, 2002]。推荐在孕28周和孕34周进行预防性注射外源性抗D。因外源性抗D的使用，筛检出的阳性抗体增加，而免疫性抗D则相对减少[Mayne et al, 1997; MacKenzie etal 1999]，而实验室检测无法区别这两种抗体。
误解主动免疫抗D和被动免疫抗D产生的风险是明显的：如果被动免疫抗D误解成为主动免疫抗D，可能忽略抗D预防而使妇女遭受致敏；如果主动免疫抗D误解成为被动免疫性抗D，可能减少对妊娠时进行抗体水平的适时检测，使胎儿遭受风险。
推荐设计的试验计划使操作透明，来保护那些包括D阴性的妊娠妇女和她们的婴儿。
知情同意
如果血试验信息和取得同意是一种临床责任，在采集样本之前应该获得知情同意和书面证明[National Collaborating Centre forWomen’s and Children’s Health, 2003].。关于选择和知情同意这些问题的讨论不在指南之内，这里不做说明。
1实验室实验的目的
1.1 ABO和D 分型试验来鉴别需要抗D预防的D阴性妇女
1.2 红细胞抗体筛选和鉴定
检测出可能影响胎儿和/或新生儿有显著临床意义的抗体
强调可能出现的输血问题
1.3 随即进行有显著临床意义抗体的实验
监测抗体强度，来鉴别那些有HDN风险的妊娠妇女和可能需要HDN治疗的胎儿/新生儿
来检测其它母体的同种异体抗体。有一种或多种抗体的妇女可能发展成更多不同特异性抗体
2 标本和申请单的建议
2.1确认标本
正确的识别孕妇标本和准确的书写申请单是重要的。SHOT提供例子说明病人识别和标本标签的错误会造成ABO不相容性输血[Stainsby et al, 2004]。可能根据出生前的标本的ABO/D类型记录来选择输血用的配血液，被用作交叉配血。错误识别标本也能导致错误的或不恰当的外源性抗D的使用。
因此，输血前标本需要病人的产前标本和申请单的识别一样 [BCSH-e, 1999] i.e.
i]姓[正确拼写]
ii]名
iii]出生日期[不要只写几年和几岁]
iv]唯一的识别号住院号/NHS number（医保号）
在产前取标本时住院号/NHS number可能没用。在这些情况下，在同时识别标本和申请单时，地址是个适合的替代者。
建议1
产前筛查标本的标准与产前输血标本的标准一样(Good Practice Point [GPP])
建议2
在病人在场下，标本应该注明日期，标签，和抽血人姓名，并向病人核实细节。标签在抽血前打印。标本上不采用打印的地址标签[BCSH-b, 2004, Level IV, Grade C].
在妊娠时任何预先的预防性抗D治疗，包括时间和剂量，记录在实验室申请单上。
临床史，尤其是HDN和输血史，也是记录在申请单上的重要信息。
3 实验室实验的建议
3.1所有实验操作程序的制定和确认必须符合已出版的指南[BCSH-f, 1995]。在自动化仪器上进行实验操作，能保证阳性标本的识别和电子传输结果到妇女的电脑记录上。
建议3
输血实验室必须根据配型指南进行ABO和D分型[BCSH-b,2004].(LevelIV, Grade C)
3.2 D型
采用不能鉴别DVI单克隆IgM抗D分型试剂，除非标本在可靠的自动化仪器上检验，试剂进行双份测试。抗CDE试剂不能作为孕妇常规分型。[BCSH-b, 2004].
D型母体血中不采用抗人球蛋白试验。用单个抗D试剂或一组多个试剂得到的微弱阳性结果不能将妇女划为D阳性。如果结果没有达到明显阳性的截断点时，在参比实验室确诊D阳性之前，将妇女划为D阴性更安全[BCSH-b, 2004]。
建议4
所有被检测为D阴性的妇女必须用血型卡来确证，这样对她们D阴性状态和需要外源性抗D而负责(Level IV, Grade C).
3.3抗体筛查
大约1%的孕妇发现有临床意义的红细胞抗体[Howard et al, 1998]。这些抗体中，最普遍特异的是抗D，虽然预想普遍采用RAADP来减少这种致敏率。然而，由于外源性抗D的检测，采用RAADP导致抗体阳性筛查结果的上升[Dalton 2003; Parker 2003]。
3.3.1筛查方法
采用LISS标准的红细胞试剂的间接抗球蛋白试验最适合检测临床意义的红细胞抗体[BCSH-b, 2004]。圆孔凝集试验，液相试管法和固相法不适合。[Poole, 1996].
用酶技术来筛查抗体没有其它价值[Clark et al, 1999].。
不推荐检测抗A或抗B水平很高的孕妇，她们的状态既不能预测ABO HDN，也不会引起宫内问题。
3.3.0试剂细胞
筛查抗体细胞必须符合指南中输血实验室中配型程序的建议[BCSH-b, 2004].
筛查细胞必须能检测出下列抗体：
C,c,D,E,e,K,k,Fya, Fyb, Jka, Jkb,S, s, M, N, Lea.
建议一种筛检细胞应该是R1R1，另一种是R2R2，。Fya, Fyb, Jka, Jkb, S和 s 抗原必须是纯合子试剂细胞。筛检细胞不能混合。
没有必要使用Cw, Kpa or Lua等抗原纯度较低筛检细胞 [Garratty, 2003].
建议5
红细胞抗体筛检的筛检细胞和方法必须符合输血实验室配血程序的指南。BCSH b 2004 (Level IV, Grade C)
4产前诊断记录
参考标本和试验要求的规则
4.1常规试验
所有孕妇必须在妊娠早期采集标本，最好在妊娠10-16周做ABO和D分型和红细胞抗体筛检。当筛检抗体阳性时，应进一步试验确定抗体的特异性和意义。[see section 5.3]
所有孕妇，无论是D阳性还是阴性，在28周再采集一次标本重测ABO和D分组和同种异体抗体筛查。[National CollaboratingCentre for Women’s and Children’s Health, 2003]。在妊娠晚期，D阳性孕妇与阴性孕妇一样易形成除抗D以外的其他抗体。
在28周后常规血型和抗体筛查没必要
有个现象，在娠末三个月检测出的抗体不引起HDN [Rothenberg et al, 1999; Heddle et al, 1993]。采用RAADP会使D阴性孕妇28周后的标本中检出抗D[Dalton 2003; Parker2003]。
建议6
所有孕妇在妊娠早期和28周必须进行ABO和D分型和红细胞抗体筛检[NationalCollaborating Centre for Women’s and Children’sHealth, 2003]. (Level III, Grade B)
能使用RAADP孕妇，在28周时初次RAADP注射前，当地保险能保证她们进行妊娠末三个月时的抗体筛检。在注射后采集标本会导致外源性抗D的检出，误认为免疫性抗D [New et al, 2001]
4..2妊娠中的致敏事件
指南有部分关于使用抗D预防的概要[BCSH-c, 2005].
See algorithm, Page x
除了使用RAADP，D阴性孕妇为以下可能的致敏事件做抗D预防：
羊膜穿剌术
脐穿刺
其他宫内治疗性介入/手术（宫内输血，分流术等）
产前出血(APH)
绒膜绒毛取样
异位妊娠
外回转术
跌倒 /腹部创伤
胚胎死亡
流产
终止妊娠
在12周以前，检查确定易流产或轻微无痛阴道出血的，没必要进行抗D 检测，因为胎儿-母体溶血危险极小[FMH]
12-20周之间，有上述任何致敏因素，D阴性孕妇必须采集标本检测来确认未被D抗原致敏。在致敏72小时内尽可能快使用至少250iu的抗D免疫球蛋白预防。在妊娠20周内没必要进行胎儿向母体出血FMH量的估计。
在20周后必要进行胎儿向母体出血FMH量的估计。如果使用酸洗脱技术，并显示胎儿向母体出血FMH量大于4ml，必须用流式细胞术进行重复试验。在潜在致敏事件发生72小时内尽快进行至少500iu抗D免疫球蛋白肌肉注射。如果流式细胞术结果显示胎儿向母体出血FMH量大于4ml，需要更多的抗D免疫球蛋白使用[BCSH-c,2005].
出生后，进行脐血测定来获得婴儿ABO和D血型。如果某种原因没采集，可尽快采集足后跟标本进行测定。
若胎儿向母体出血被母体血循环所分散，致丧失充分时间，必须采集母血标本进行ABO和D血型确认和FMH试验。30-45分钟间隔是最准确的。
FMH小于4ml的孕妇，在分娩D阳性婴儿后至少使用500iu抗D.
如果妊娠失败或无法从婴儿采集标本，必须使用外源性抗D。
4.3 妊娠中检测红细胞抗体
如果检测到红细胞抗体，母血进行进一步实验来确定抗体特异性，浓度，抗体来源和水平，
和发生HDN的可能性。
抗D，抗c，抗K经常一起引起溶血性疾病，应做足够的产前干预
4.3.1抗D阳性的妇女
区别外源性性和免疫性抗D
在致敏事件发生后，除了使用外源性抗D外，采用 NICE推荐的RAADP在不断增加[NICE,2002]。因此更多含有低水平抗D的母血标本不可避免会出现这问题：确定抗D是外源性还是免疫性。
肌肉注射抗D免疫球蛋白后，血清学检测会立刻发现抗D，并且高峰会持续3-7天。外源性抗D免疫球蛋白的半衰期大约是3周[Eklund et al, 1982]。几周内用血清学方法能检测到外源性抗D：IAT法能达到8周或更多，用其它更敏感方法能达到12周，罕见病例能达数月。
免疫性抗D大约在接触D阳性细胞4周后能检测，在6-8周后达到峰值[Mollison et al c, 1997].
外源性和免疫性抗D均能被实验室检测并且无法区分。外源性抗D水平会随时间下降，而免疫性抗D水平通常会保持稳定或再次受刺激时会上升。
预防后，母体血抗D水平很少超过1iu/ml，除非刚接受超过1250iu剂量的预防
在怀疑有预防性抗D时的措施
a 若在过去8周里有使用抗D的记录，抗体反应轻微，对没有抗体测定的28周后未致敏妇女应该进行检测和Rh预防。
b 若无抗D使用记录或无有效预防信息，在28周内每隔4周或28周后每隔2周对受免疫的妇女等同时进行IAT和抗D定量。如果抗D不被IAT检测出，D定量水平很低，说明是外源性抗体。升高或稳定的D定量水平显示是免疫性抗D
对免疫性或被动自然性抗D有明显怀疑，标本应该做定量。
除非确定是免疫性抗D，任何一种情况都应进行抗D免疫
在确定抗D为免疫性前，被检测为抗D阳性孕妇不能在抗体卡上记录发现了抗D。
如果有检测到抗D的标本来作为常规抗体筛查或输血前检查，必须选择一组含有全部相关红细胞抗原的D阴性细胞来检测出或排除其它特异性同种异体抗体的存在
建议7
输血实验室应该保存一份抗D使用记录，是作为区别免疫性或外源性抗D的基本方法(Level IV, Grade C).
5.3.2免疫性抗D阳性的妇女
在妊娠28周前，免疫性抗D阳性的妇女
必须每月至少进行一次标本采集检测，此后每隔两周进行抗D水平检测来鉴别可能产生其它抗体。根据国家抗D标准，抗体水平必须定量至iu/mL [National Institute for Biological Standards and Control (NIBSC),2003]。每个标本与以前标本平行检测，结果比较来发现抗体水平上有意义的改变
抗D是最常见导致严重HDN的抗体。以前的指南根据下面的抗D水平值来指导妊娠处理[BCSH a, 1996; Nicolaides & Rodeck,1992]
抗D 小于4 iu/mL HDN不可能
抗D 4-15 iu/mL HDN中度危险
抗D 超过15 iu/mL 胎儿水肿高度危险
随着胎儿贫血鉴定和IUT宫内输血技术的发展，有意义的抗D水平使形成医学专家的胎儿-母体治疗单位。采用非侵入性检测来预测胎儿贫血[Scheier et al, 2004]。抗D水平是4 iu/mL的，和/或抗D水平正在上升的，和/或有HDN史的妇女会对胎儿产生影响，必须考虑成为一个整体。应该注意的是据报道HDN的抗体水平有小于4 iu/mL [Bowell et al, 1982]。一旦归为胎儿-母体治疗单位，随后的抗体定量的标本的价值就可疑了。28周的标本应该进行更进一步的红细胞抗体检测。
根据7片段的PCR技术用母体外周血标本来确定胎儿D型是可能的[Danielset al a, 2004]
4.3.3有显性抗C+D，可能抗G的妇女
用先进的血清学技术，一部分比例的显性特异性抗C+D但含有不成比例的高滴度抗C，被证明是抗G[Maley et al, 2001]。既然含有抗G而无抗D 的妇女应该有资格使用RAADP和产后免疫球蛋白，那么一个参比中心来保证标本抗C+D特异性是重要的
4.3.4免疫抗c阳性的妇女
免疫抗c阳性的妇女应该像抗D阳性的妇女那样重复检测，28周前每月一次和其后每隔两周一次等。参照国际抗c标准，免疫抗c阳性的妇女的标本应该进行抗c定量[NIBSC 2003]，就像上述抗D那样进行平行检测，也应该鉴别其它抗体
抗c定量实验对监视抗体浓度的发展是有用的
当考虑HDN史时，下面的抗c水平对需要成为医学专家治疗对象时是有指示必要[Kozlowski et al,1995].
抗c水平
小于7.5 iu/mL 继续监视
7.5 to 20 iu/mL HDN中度危险，成为医学专家治疗对象
超过20 iu/mL 严重HDN危险，成为医学专家治疗对象
重要注意的是抗c可能会引起新生儿迟发性贫血。
4.3.5免疫性抗K或其它K系统抗体阳性的妇女
抗K引起的HDN以低血红蛋白为特征，但没有报道羊膜和/或脐带胆红素水平。早期K阳性红系受抑制[Vaughan et al, 1998]或免疫功能进一步破坏[Danielset al b, 2003]导致抗K胎儿贫血。
公认抗K导致的HDN的严重程度与抗体滴度无关，但也有报道受影响的妊娠与抗体滴度大于32有关联[McKenna et al, 1999; Ahaded et al, 2000]。然而，妊娠时首次检测到抗K阳性的妇女标本时，应该用IAT法做抗K滴度测定，鉴定含有其它有临床意义的抗体。
大多数抗K妊娠妇女的病例是早期K阳性细胞输注导致的。选择K阴性血液输注给有生育潜力的妇女，来减少抗K的发生率[Lee & de Silva, 2004]。因此给60岁以下的妇女输注K阴性血液可考虑为一个好的实践。在没有K阴性血液时，紧急输血也可采取其它血液。
应该记录抗K阳性妇女的输血史，配偶的标本也应该进行K分型。如果妇女没有输血史和配偶是K阳性，妇女应该考虑为医学专家治疗对象，在28周前每月和28周后每半个月进行抗体滴度测定。如果配偶是K阴性，在28周前确认他与胎儿是亲子关系，可在28周后进行K抗体和其他抗体滴度测定。
从羊水标本能对胎儿进行K分型，但是采集标本会对胎儿造成物理损害和刺激抗体水平。随着母体外周血标本K基因分型技术的发展，能根据PCR技术（见7章节）进行胎儿基因分型。
建议8 抗D抗c抗K的病例[除了父亲确认为K阴性]，在28周前应该每月进行检测和28周后每半月检测。这些病例应该考虑为医学专家治疗对象，直到抗体水平达到临界水平或显著在上升。(Grade B)
4.3.6含有其它红细胞抗体的妇女
只有IgG抗体能进入胎儿血循环。IAT法能检测出有临床意义的IgG红细胞抗体。冷反应素、IgM和由高频率抗原产生的低亲和力抗体[如抗体相关CR1和 CR4]与HDN无内在关联。
除了抗D抗c抗K，下列的特异性抗体也与HDN有关：抗-C [-Ce], -E [-cE], -Fya, 和-Jka [ Moise, 2000;Moran2000; Goodrick et al, 1997]。然而，有许多其它引起HDN的特异性抗体，Daniels等人用血型系统做了概括[Daniels et al c, 2002]。在所有这些病例中，通常在28周再次测定来，为妊娠处理提供充分的信息。对以前的孩子有HDN史的妇女应该根据重复试验来进行医疗决策。
当发现一个抗体时，双份预约试验，不用杂合的试剂细胞，检测28周标本，包括用相关抗原进行滴度和IAT法检测。技术操作谨慎注意，推荐作为室内质控，在减小方法误差和国家抗D标准[NIBSC,2003]滴定平行试验时是必要的[BCSH d, 1999]。假设推行广泛使用RAADP计划，除了同种异体抗体之外，可能会出现外源性抗D，应考虑D阴性试剂细胞做滴度试验。
一般而言，32或更大的滴度易于引起HDN，虽然还没建立滴度与HDN之间的明显截断点。
应该检测出其他更多抗体，上述的临床有意义的抗体应该定量。
建议9
在初次预约和妊娠28周时应该检测除了抗D抗c抗K之外的临床有意义的抗体，并排除其它抗体(level IIb Grade B)
建议10
建议所有孩子有HDN史的孕妇在20周前应该考虑为一个医学专家治疗对象，来评估胎儿溶血，与抗体水平无关。(Level IIaGrade B)
5父亲检测
临床有意义的抗体，尤其是抗D抗c抗K，能引起HDN，存在于母血标本，此时确定父亲基因型能预测胎儿携带相关红细胞抗原的可能性。也必须承认父亲基因型检测的复杂性和潜在的错误诊断。[National Collaborating Centre for Women’s and Children’s Health, 2003].
6 胎儿基因分型
当有一个临床意义的高浓度抗体，和/或母亲有HDN史，父亲是相关抗原的杂合子，对确定胎儿基因型有临床关联。最近用羊水和绒膜绒毛标本进行PCR测定对胎儿DNA分型。这些侵入性操作会带来自发性流产的风险和可能增加母体抗体水平。现在有一种用母体外周血浆准确检测D基因型的技术。
现在还不行对胎儿c和K型进行同样试验，当试验有效时应该采用。
7 实验室检查结果报告
报告中除了血型和特异性红细胞同种异型抗体，还必须告知负责有意义抗体的妇女的产前保健的临床医师，关于HDN的发展和输血问题[National Collaborating Centre forWomen’s and Children’s Health 2003]。报告也应该警示医师，有相关抗体时，将妇女考虑成为一个医学专家治疗对象。
还应该详细说明进一步检查的标本采集的时间
建议11
临床有意义红细胞同种异体抗体阳性的妇女应该在卡上记录抗体的详细信息(GPP)
8 出生时的措施
8.1 无免疫性抗D的D阴性妇女
采集母血和脐血标本。脐血标本来鉴定婴儿的D型，用来决定妇女是否使用产后外源性抗D免疫球蛋白
有个小现象，婴儿上的DVI抗原能使母体致敏，检测脐血DVI使用与成人不同的试剂，这样会使混淆可能和成人标本不恰当的检测，因此不推荐脐血标本DVI 检测，脐血分型标本抗D试剂不与DVI反应。大多数弱D抗原标本能被高亲和力抗D试剂检测[BCSH b, 2004]
检测母血标本来估计胎儿血量，如果在发生胎儿向母体出血[FMH]超过4ml时给予其它抗D免疫球蛋白治疗。酸洗脱技术检测出FMH超过4ml结果的标本，应该用流式细胞术检测来更准确评价出血量。根据FMH的量来计算外源性抗D的剂量[BCSH c, 2006]
8.2脐血直接抗球蛋白试验[DAT]
8.2.1 D阴性妇女生产的D阳性婴儿脐血常规DAT
不建议采用。使用RAADP后的抗D 免疫球蛋白能通过胎盘，进入胎儿血循环与胎儿D抗原位点相结合。因此，发现高达3-6%D阳性脐血标本用DAT试验阳性[Dalton, 2003; Parker 2003]，这可能导致没必要的额外检查和病人焦虑。有证据表明外源性抗D不引起胎儿/婴儿红细胞的破坏。[Maayan-Metzger et al, 2001]
8.2.2有IAT反应性红细胞抗体的妇女的婴儿进行DAT
发现母体血清含有免疫性，IAT反应性红细胞抗体，应该进行脐血DAT。
DAT阳性本身不能诊断HDN。然而，如果它是阳性的，应该检查新生儿溶血和胆红素水平来诊断/排除HDN。当DAT是阳性和婴儿显示HDN症状时，检测红细胞洗出液对确诊红细胞抗体特异性可能有帮助。对HDN可疑病例，应用脐血红细胞检测相应抗原。
婴儿在宫内输注几单位相关阴性抗原的血时，出生后数月内DAT可能是阴性的，抗原分型也是阴性的。
建议12
应该密切观察所有有临床意义抗体的妇女的婴儿的HDN迹象。应进行DAT，如果是阳性症状，应检测血红蛋白和胆红素水平(Level IV, Grade C)
8.3 产前和产后母血检测
不需要立即对产前和/或产后标本进行常规抗体筛检，结果不会影响妊娠妇女和她婴儿的处理。在需要输血配合试验前，应该进行除确诊的D型外的血型分型和抗体筛检。
9 前景
关于使用RAADP [NICE, 2002]中的NICE指南，支持对母体血浆用循环胎儿DNA分析进行产前胎儿血型集中检测的可行性研究。‘如果在妊娠28周前确定胎儿Rh血型，只有在胎儿RhD阳性和不知道父亲血型情况下，产前抗D预防是必要的’。这预示着在不久将来大规模试验变得有用。[Daniels et al a,2004].
10 统计
根据不断完善的指南来进行统计，检测结果符合指南规定的误差和注意点[Department of Health (DH) a1997; DH b, 1998].